Screening adalah sejenis tes yang
digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi spesifik atau mikroorganisme dalam
sejumlah besar spesimen. Tes skrining relatif mudah dan tidak mahal (peralatan
yang dibutuhkan tidak terlalu rumit). Beberapa tes skrining masih dapat
dilanjutkan dengan tes lain yang lebih spesifik. (Margino, 2008).
Screening
Metabolit Sekunder (Antibiotik) Oleh Isolat Jamur Endofit (Margino,2008)
a. Tahap Persiapan
Ranting tanaman dipotong sepanjang
1 cm. Untuk mensterilkan permukaan, potongan ranting direndam di dalam larutan
Byclean atau Chlorox 5 % selama 5 menit, diikuti dengan perendaman dalam air
steril selama 2 menit, entanol 70% selama 1 menit, dan air steril selama 2
menit. Potongan yang telah disterilkan dihilangkan ekses airnya dan selanjutnya
dibelah menbujur menjadi 2 bagian. Inokulasi dilakukan dengan cara meletakkan
permukaan belahan pada permukaan medium CMM (corn meal malt extract) agar untuk
isolasi fungi atau Nutrien agar untuk isolasi bakteri. Inkubasi dilakukan
selama 4-7 hari. Koloni mikrobia diisolasi dengan ose, selanjutnya isolat fungi
dipelihara pada medium PDA miring dan isolat bakteri dipelihara pada Nutrien
agar miring sebagai kultur stok murni (Bacon, 1988; Margino, 1997).
b. Tahap Screening
Langkah pertama seleksi dilakukan
dengan teknik “paper disc diffusion technique”, yakni dengan jalan mencelupkan
paper disc ke dalam supernatan dan hindarkan ekses air. Paper disc yang sudah
bebas ekses air diletakan pada medium yang mengandung mikrobia indikator
Bacillus subtilis, Candida albicans, dan Fusarium oxysporum f.sp. licopersicae
dan diinkubasi pada suhu kamar, selama 2 hari. Terbentuknya zona jernih di
sekitar paper disc menggambarkan adanya aktivitas penghambatan oleh senyawa
antimikrobia (antibiotik) terhadap mikroba indikator. Seleksi isolat dilakukan
dengan mengkompilasi hasil uji ini. Isolat yang memiliki nilai rasio lebih
besar 4 menjadi kandidat isolat unggul.
Isolasi
Dan Penapisan Aktinomisetes Laut Penghasil Antimikroba(antibiotik)
a. Tahap Persiapan
Lima gram tiap sediment laut
diambil pada kedalaman rata-rata 20-50cm. Masing-masing sampel ditempatkan pada
falcon tube 15mL dan ditutup rapat. Sampel disimpan dalam ruang dingin sebelum
dilakukan proses isolasi.
Sebanyak 1 gram padatan sampel dipisahkan air lautnya
dengan cara didekantir. Empat mililiter air steril ditambahkan ke dalam sampel
tersebut dan diaduk selama 10 menit dan didiamkan sampai suspensi mengendap.
Sebanyak 1 ml cairan sampel diambil dan diencerkan dengan air steril sebanyak 4
mL. Proses pretreatment dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan cara asam dan
pemanasan. Pretreatment dengan cara asam dilakukan dengan penambahan asam
klorida sampai pH 2 dan didiamkan selama 2 jam. Pretreatment dengan cara panas
dilakukan mengacu pada metode Pisano et al. (1986) yang dimodifikasi, yaitu
dengan memanaskan cairan sampel pada suhu 650C selama 60 menit.
Cairan sampel yang telah
ditreatment selanjutnya diencerkan secara seri dari 10-1 sampai dengan 10-5.
Selanjutnya 0.1 ml sampel yang telah diencerkan, di-sebarkan pada permukaan
agar media isolasi. Komposisi media agar untuk isolasi adalah sebagai berikut;
10 gr soluble starch, 2 gr pepton, 4 gr yeast ekstrak, 16 gr agar dalam 1000 mL
air laut. Medium tersebut ditambahkan juga beberapa antibiotik 100 µgr/ml cy-cloheximide,
25 µgr/ml nistatin, 100 µgr/ml nalidic acid, dan 5 µgr/ml rifampin. Antibiotik
ditambahkan setelah medium agar disterilisasi. Inkubasi dilakukan pada suhu 300
C dalam inkubator. Koloni aktinomisetes yang tumbuh dipisahkan dan dipindahkan
ke dalam medium agar yang baru dengan menggunakan marine agar. Pemindahan
dilakukan sampai diperoleh koloni tunggal
Koloni aktinomycetes yang telah
dimurnikan lalu ditumbuhkan pada medium broth YEME selama 2 hari, dan
ditransfer ke medium fermentasi dengan komposisi medium Bacto peptone 15 gr/L,
yeast extract 3 gr/L, Fe citrate n H2O 0,3 gr/L, demin water 250mL, dan air
laut 750mL. Fermentasi dilakukan selama 5 hari dengan inkubasi pada suhu 300C.
Broth fermentasi dikeringkan dengan freeze drying dan diekstraksi dengan
metanol. Ekstrak dalam metanol siap diuji aktivitasnya.
b. Tahap
Screening
Tahapan penapisan(screening)
aktinomisetes penghasil anti-mikroba dilakukan dengan uji antibakteri dan
antijamur dengan metode kertas cakram. Mikroba uji yang biasa digunakan untuk
mengetahui keefektifitasan actinomycetes adalah Eschereschia coli,
Streptococcus aereus, Pseudomonas aeroginosa, Bacillus subtilis, Aspergillus
niger, dan Candida albican. Eschereschia coli, Streptococcus aereus,
Pseudomonas aeroginosa,
Bacillus subtilis ditumbuhkan pada media nutrien
agar dan Aspergillus niger, dan Candida albican ditumbuhkan pada Potato
Dextrose Agar. Keduanya dilakukan dengan metode pour plate methods.
Setelah itu, Sebanyak 15 µL ekstrak
sampel diteteskan dalam kertas cakram berukuran 6 mm, kemudian dikeringkan.
Selanjutnya diletakkan pada permukaan agar yang telah diinokulasikan mikroba
uji. Inkubasi dilakukan pada suhu 300 C selama 24 jam. Zona bening yang
terbentuk yang menunjukkan aktivitas antimikroba yang mampu menghambat
pertumbuhan mikroba uji diukur diameternya.
Setelah terbentuknya zona bening lalu ditentukan Minimum Inhibition
Concentration.
Minimum Inhibition Concentration
(MIC) ditentukan dengan cara melarutkan ekstrak broth pada berbagai konsentrasi
yaitu dari konsentrasi 10.000 µg/ml sampai dengan 100 µg/ml. Masing-masing
konsentrasi diuji aktivitas antibakterinya menggunakan metode difusi agar.
Diameter kertas cakram yang digunakan adalah 6 mm. Zona bening yang terbentuk
diukur diameternya. Selanjutnya dibuat kurva Log [C] (kon-sentrasi) sebagai
sumbu Y melawan X2 (diameter zona bening) sebagai sumbu X. Titik potong sumbu Y
pada X=0 merupakan nilai Log MIC. Metode penentuan MIC ini mengikuti Bonev et
al., 2008 yang dimodifikasi.
Metode
Screening Bakteri Yang Berasosiasi Dengan Spons Jenis Aplysina sp
(Devin et al, 2012)
a. Tahap persiapan
Spons dimasukan kedalam kantong
plastik steril kemudian disimpan di dalam ice box dan dibawa ke laboratorium.
Bakteri yang terdapat pada sampel spons diinokulasi pada media NA dengan metode
agar tuang (Lay,1994). Sampel spons dihaluskan dengan menggunakan blender,
kemudian diambil sebanyak 1 gr dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang
berisi 9 ml air laut. Dilakukan pengenceran hingga konsentrasi menjadi 10-6, Kemudian sampel diinokulasi dengan metode
agar tuang, diambil sebanyak 1 ml untuk diinokulasi pada media NA dalam cawan
petri 15 ml secara aseptik kemudian
diinkubasi pada suhu 370C di dalam inkubator selama 2 x 24 jam. Setelah itu
isolat dimurnikan yang bertujuan untuk memisahkan hasil inokulasi yang terdiri
dari banyak koloni bakteri yang berlainan jenis sehingga didapat koloni bakteri
murni pada setiap biakan bakteri. Koloni bakteri yang diambil untuk dimurnikan
adalah koloni yang dominan. Pemurnian dilakukan dengan menggunakan metode
streak. Setelah itu dilakukan inokulasi bakteri uji dan bakteri yang akan diuji
pada media NB sehingga diperoleh suspensi bakteri uji dan suspensi bakteri yang
akan diuji (Nofiani et al. 2009).
b. Tahap screening
Bakteri uji yang digunakan harus
mewakili bakteri gram positif dan gram negatif. Suspensi bakteri uji diambil
sebanyak 200 μl dan dimasukan kedalam 15 ml NA yang mulai mendingin namun masih
cair kemudian dikocok hingga merata dan dituangkan ke cawan petri kemudian dibiarkan
hingga membeku. Setelah membeku letakkan kertas cakram yang telah dibasahi
dengan suspensi bakteri spons yang akan diuji kemudian diinkubasi selama 24
jam, setelah diinkubasi dilihat apakah terdapat zona bening disekitar koloni
bakteri yang diuji yang tumbuh disekitar kertas cakram. Jika terdapat zona bening maka bakteri
tersebut menghasilkan senyawa bioaktif sebagai antibakteri (Nofiani et al.
2009).
Metode
Skrining Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp. Sebagai
Penghasil Senyawa Antimikroba(Abubakar
et al, 2011)
a. Tahap Persiapan
Spons Jaspis sp. diambil
menggunakan pisau steril dengan ukuran panjang sampel 5–10 cm Sampel kemudian dimasukkan ke dalam
plastik sampel (Whirl-Pak, Nasco, USA) yang telah diisi oksigen murni,
selanjutnya ditempatkan dalam cool box untuk analisis di Laboratorium. Setelah itu dilakukan
Isolasi bakteri dari sampel spons tersebut. Permukaan sampel spons disemprot
air laut steril dengan perbandingan ukuran spons 1 cm2 : 5 ml air laut steril,
sehingga hanya bakteri dengan daya gabung yang kuat saja yang akan tersampling.
Bagian mesohil diambil dengan ukuran + 1x1 cm, digerus dan diencerkan dengan
Phospat Buffer Saline (PBS) steril dengan perbandingan 1:1 (Kim et al., 2006).
Isolasi bakteri dari permukaan luar menggunakan swab steril (Wahl et al.,
1994), yang diusapkan dengan satu arah pada permukaan luar spons. Swab steril
yang telah diusapkan pada permukaan sampel dimasukkan ke dalam tabung
pengenceran yang berisi PBS steril dan divorteks . Hasil pengenceran disebar ke
dalam cawan petri yang telah berisi media Sea Water Complit (SWC) dengan
komposisi 1 liter media terdiri dari 5 gr/l bacto pepton, 1 gr/l yeast extract
dan 3 ml/l glycerol, dan diinkubasi pada suhu 26oC selama 24-36 jam dan diamati
pertumbuhan koloni bakterinya. Setiap koloni bakteri yang tumbuh dipisahkan
berdasarkan warna, ukuran dan bentuk koloni, serta dimurnikan dengan
menggunakan media yang sama.
b. Tahap Screening
Screening dilaksanakan dengan
pengujian aktivitas antagonis terhadap bakteri dan khamir patogen dilakukan
secara kualitatif modifikasi Marinho et al., (2009), dengan menggores Isolat
pada permukaan media yang telah disebar dengan bakteri uji. Bakteri uji yang
digunakan terdiri dari bakteri gram negatif yaitu Escherichia coli, Pseudomonas
aerogenosa patogen manusia serta bakteri
Gram positif yaitu Staphylococcus aureus patogen dan S. aureus . Penguiian aktivitas
antikhamir menggunakan khamir uji Candida albicans yang ditumbuhkan pada media
Potato Dextrose Agar (PDA). Aktivitas antagonis terhadap bakteri dan khamir
diindikasikan dengan terbentuknya zona jernih disekitar koloni isolat murni.
KESIMPULAN
Screening adalah sejenis tes yang
digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi spesifik atau mikroorganisme dalam
sejumlah besar spesimen. Tes skrining relatif mudah dan tidak mahal (peralatan
yang dibutuhkan tidak terlalu rumit). Beberapa tes skrining masih dapat
dilanjutkan dengan tes lain yang lebih spesifik.
Metode Skrining
diantaranya :
-
teknik “paper disc diffusion technique”,
-
uji antibakteri dan antijamur dengan
metode kertas cakram
-
pengujian aktivitas antagonis terhadap
bakteri dan khamir patogen dilakukan secara kualitatif modifikasi
Metode Skrining pada mikroba sebelum dilakukan
diperlukan tahap persiapan terlebih dahulu . Tahap persiapan biasanya sangat
tergantung dengan jenis mikroorganisme dan karakteristiknya, misalnya dalam uji
pewarnaan gram untuk bakteri, keasaman, temperatur, dan karakter mikroorganisme
lainnya.
DAFTAR PUSTAKA
Abu
bakar et al, 2011. Skrining Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp.
Sebagai
Penghasil Senyawa Antimikroba. ILMU KELAUTAN. Vol. 16 (1) 35-40
Penghasil Senyawa Antimikroba. ILMU KELAUTAN. Vol. 16 (1) 35-40
Defin
et al, 2012. Penapisan Bakteri yang Bersimbiosis dengan Spons Jenis Aplysina sp
sebagai Penghasil Antibakteri dari Perairan Pulau Tegal Lampung. Sumatera selatan.
Universitas sriwijaya, Palembang
sebagai Penghasil Antibakteri dari Perairan Pulau Tegal Lampung. Sumatera selatan.
Universitas sriwijaya, Palembang
Kim,
T.K., Hewavitharana, A.K., Shaw, P.N., & Fuerst, J.A. 2006.Discovery of a
new source
of rifamycin antibiotics in marine sponge actinobacteria by phylogenetic prediction.
Appl. Environ. Microbiol., 72: 2118–2125
of rifamycin antibiotics in marine sponge actinobacteria by phylogenetic prediction.
Appl. Environ. Microbiol., 72: 2118–2125
Lay.
B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada.
Jakarta. 167
hlm.
hlm.
Margino,
S., 1997. "Tropical bioresources consevation for production useful
materials".
Training report. November 2-14 1997. Lab. Of Bioscience and Biochemistry, Faculty
of Agriculture, Hokkaido University, Sapporo, Japan
Training report. November 2-14 1997. Lab. Of Bioscience and Biochemistry, Faculty
of Agriculture, Hokkaido University, Sapporo, Japan
Bacon,
F. W., 1988. Procedur of Isolating the Endophytes from Tall Fescue and
Screening
Isolates for Ergot Alkaloids. Appl. Environ. Microbiol., 54:2615-2618
Isolates for Ergot Alkaloids. Appl. Environ. Microbiol., 54:2615-2618
Margino,
Sebastian. 2008. Produksi metabolit sekunder (antibiotik) oleh isolat jamur
endofit
Indonesia. Majalah Farmasi Indonesia, 19(2), 86 – 94, 2008
Indonesia. Majalah Farmasi Indonesia, 19(2), 86 – 94, 2008
Marinho,
P.R., Paula, A., Moreira, B., Lúcia, F., Costa,P., & Muricy, G. 2009.
Marine
Pseudomonas putida: a potential source of antimicrobialsubstances against antibiotic
-resistant bacteria.Mem. Inst. Oswaldo Cruz., 104: 678-682
Pseudomonas putida: a potential source of antimicrobialsubstances against antibiotic
-resistant bacteria.Mem. Inst. Oswaldo Cruz., 104: 678-682
Nofiani.
R, Nurbetty. S, Sapar. A. 2009. Aktifitas Antimikroba Ekstrak Metanol Bakteri
Berasosiasi Spons Dari Pulau Lemukutan Kalimantan Barat. Universitas Tanjung
Pura: Pontianak.
Berasosiasi Spons Dari Pulau Lemukutan Kalimantan Barat. Universitas Tanjung
Pura: Pontianak.
Pisano.
M. A., Michael. J.S., & Madelyn. M.L., 1986. Application of pretreatments
for the
isolation of bioactive actinomycetes from marine sediments. Appl Microbiol.
Biotechnol 25:285-288
isolation of bioactive actinomycetes from marine sediments. Appl Microbiol.
Biotechnol 25:285-288
Wahl,
M., Jensen, P.R., Fenical, W.1994. Chemical control of bacterial epibiosis on
Ascidians. Mar. Ecol. Prog. Ser., 110: 45–57.
Ascidians. Mar. Ecol. Prog. Ser., 110: 45–57.