Screening Mikrobiologi

Screening adalah sejenis tes yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi spesifik atau mikroorganisme dalam sejumlah besar spesimen. Tes skrining relatif mudah dan tidak mahal (peralatan yang dibutuhkan tidak terlalu rumit). Beberapa tes skrining masih dapat dilanjutkan dengan tes lain yang lebih spesifik. (Margino, 2008).

Screening Metabolit Sekunder (Antibiotik) Oleh Isolat Jamur Endofit (Margino,2008)

a. Tahap Persiapan

Ranting tanaman dipotong sepanjang 1 cm. Untuk mensterilkan permukaan, potongan ranting direndam di dalam larutan Byclean atau Chlorox 5 % selama 5 menit, diikuti dengan perendaman dalam air steril selama 2 menit, entanol 70% selama 1 menit, dan air steril selama 2 menit. Potongan yang telah disterilkan dihilangkan ekses airnya dan selanjutnya dibelah menbujur menjadi 2 bagian. Inokulasi dilakukan dengan cara meletakkan permukaan belahan pada permukaan medium CMM (corn meal malt extract) agar untuk isolasi fungi atau Nutrien agar untuk isolasi bakteri. Inkubasi dilakukan selama 4-7 hari. Koloni mikrobia diisolasi dengan ose, selanjutnya isolat fungi dipelihara pada medium PDA miring dan isolat bakteri dipelihara pada Nutrien agar miring sebagai kultur stok murni (Bacon, 1988; Margino, 1997).

b. Tahap Screening

Langkah pertama seleksi dilakukan dengan teknik “paper disc diffusion technique”, yakni dengan jalan mencelupkan paper disc ke dalam supernatan dan hindarkan ekses air. Paper disc yang sudah bebas ekses air diletakan pada medium yang mengandung mikrobia indikator Bacillus subtilis, Candida albicans, dan Fusarium oxysporum f.sp. licopersicae dan diinkubasi pada suhu kamar, selama 2 hari. Terbentuknya zona jernih di sekitar paper disc menggambarkan adanya aktivitas penghambatan oleh senyawa antimikrobia (antibiotik) terhadap mikroba indikator. Seleksi isolat dilakukan dengan mengkompilasi hasil uji ini. Isolat yang memiliki nilai rasio lebih besar 4 menjadi kandidat isolat unggul.

Isolasi Dan Penapisan Aktinomisetes Laut Penghasil Antimikroba(antibiotik)

a. Tahap Persiapan

Lima gram tiap sediment laut diambil pada kedalaman rata-rata 20-50cm. Masing-masing sampel ditempatkan pada falcon tube 15mL dan ditutup rapat. Sampel disimpan dalam ruang dingin sebelum dilakukan proses isolasi.

Sebanyak 1 gram padatan sampel dipisahkan air lautnya dengan cara didekantir. Empat mililiter air steril ditambahkan ke dalam sampel tersebut dan diaduk selama 10 menit dan didiamkan sampai suspensi mengendap. Sebanyak 1 ml cairan sampel diambil dan diencerkan dengan air steril sebanyak 4 mL. Proses pretreatment dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan cara asam dan pemanasan. Pretreatment dengan cara asam dilakukan dengan penambahan asam klorida sampai pH 2 dan didiamkan selama 2 jam. Pretreatment dengan cara panas dilakukan mengacu pada metode Pisano et al. (1986) yang dimodifikasi, yaitu dengan memanaskan cairan sampel pada suhu 650C selama 60 menit.

Cairan sampel yang telah ditreatment selanjutnya diencerkan secara seri dari 10-1 sampai dengan 10-5. Selanjutnya 0.1 ml sampel yang telah diencerkan, di-sebarkan pada permukaan agar media isolasi. Komposisi media agar untuk isolasi adalah sebagai berikut; 10 gr soluble starch, 2 gr pepton, 4 gr yeast ekstrak, 16 gr agar dalam 1000 mL air laut. Medium tersebut ditambahkan juga beberapa antibiotik 100 µgr/ml cy-cloheximide, 25 µgr/ml nistatin, 100 µgr/ml nalidic acid, dan 5 µgr/ml rifampin. Antibiotik ditambahkan setelah medium agar disterilisasi. Inkubasi dilakukan pada suhu 300 C dalam inkubator. Koloni aktinomisetes yang tumbuh dipisahkan dan dipindahkan ke dalam medium agar yang baru dengan menggunakan marine agar. Pemindahan dilakukan sampai diperoleh koloni tunggal

Koloni aktinomycetes yang telah dimurnikan lalu ditumbuhkan pada medium broth YEME selama 2 hari, dan ditransfer ke medium fermentasi dengan komposisi medium Bacto peptone 15 gr/L, yeast extract 3 gr/L, Fe citrate n H2O 0,3 gr/L, demin water 250mL, dan air laut 750mL. Fermentasi dilakukan selama 5 hari dengan inkubasi pada suhu 300C. Broth fermentasi dikeringkan dengan freeze drying dan diekstraksi dengan metanol. Ekstrak dalam metanol siap diuji aktivitasnya.

b.  Tahap Screening

Tahapan penapisan(screening) aktinomisetes penghasil anti-mikroba dilakukan dengan uji antibakteri dan antijamur dengan metode kertas cakram. Mikroba uji yang biasa digunakan untuk mengetahui keefektifitasan actinomycetes adalah Eschereschia coli, Streptococcus aereus, Pseudomonas aeroginosa, Bacillus subtilis, Aspergillus niger, dan Candida albican. Eschereschia coli, Streptococcus aereus, Pseudomonas aeroginosa,

Bacillus subtilis ditumbuhkan pada media nutrien agar dan Aspergillus niger, dan Candida albican ditumbuhkan pada Potato Dextrose Agar. Keduanya dilakukan dengan metode pour plate methods.

Setelah itu, Sebanyak 15 µL ekstrak sampel diteteskan dalam kertas cakram berukuran 6 mm, kemudian dikeringkan. Selanjutnya diletakkan pada permukaan agar yang telah diinokulasikan mikroba uji. Inkubasi dilakukan pada suhu 300 C selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk yang menunjukkan aktivitas antimikroba yang mampu menghambat pertumbuhan mikroba uji diukur diameternya.

            Setelah terbentuknya zona bening lalu ditentukan Minimum Inhibition Concentration.

Minimum Inhibition Concentration (MIC) ditentukan dengan cara melarutkan ekstrak broth pada berbagai konsentrasi yaitu dari konsentrasi 10.000 µg/ml sampai dengan 100 µg/ml. Masing-masing konsentrasi diuji aktivitas antibakterinya menggunakan metode difusi agar. Diameter kertas cakram yang digunakan adalah 6 mm. Zona bening yang terbentuk diukur diameternya. Selanjutnya dibuat kurva Log [C] (kon-sentrasi) sebagai sumbu Y melawan X2 (diameter zona bening) sebagai sumbu X. Titik potong sumbu Y pada X=0 merupakan nilai Log MIC. Metode penentuan MIC ini mengikuti Bonev et al., 2008 yang dimodifikasi.

Metode Screening Bakteri Yang Berasosiasi Dengan Spons Jenis Aplysina sp (Devin et al, 2012)

a. Tahap persiapan

Spons dimasukan kedalam kantong plastik steril kemudian disimpan di dalam ice box dan dibawa ke laboratorium. Bakteri yang terdapat pada sampel spons diinokulasi pada media NA dengan metode agar tuang (Lay,1994). Sampel spons dihaluskan dengan menggunakan blender, kemudian diambil sebanyak 1 gr dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml air laut. Dilakukan pengenceran hingga konsentrasi menjadi 10-6,  Kemudian sampel diinokulasi dengan metode agar tuang, diambil sebanyak 1 ml untuk diinokulasi pada media NA dalam cawan petri  15 ml secara aseptik kemudian diinkubasi pada suhu 370C di dalam inkubator selama 2 x 24 jam. Setelah itu isolat dimurnikan yang bertujuan untuk memisahkan hasil inokulasi yang terdiri dari banyak koloni bakteri yang berlainan jenis sehingga didapat koloni bakteri murni pada setiap biakan bakteri. Koloni bakteri yang diambil untuk dimurnikan adalah koloni yang dominan. Pemurnian dilakukan dengan menggunakan metode streak. Setelah itu dilakukan inokulasi bakteri uji dan bakteri yang akan diuji pada media NB sehingga diperoleh suspensi bakteri uji dan suspensi bakteri yang akan diuji (Nofiani et al. 2009).

b. Tahap screening

Bakteri uji yang digunakan harus mewakili bakteri gram positif dan gram negatif. Suspensi bakteri uji diambil sebanyak 200 μl dan dimasukan kedalam 15 ml NA yang mulai mendingin namun masih cair kemudian dikocok hingga merata dan dituangkan ke cawan petri kemudian dibiarkan hingga membeku. Setelah membeku letakkan kertas cakram yang telah dibasahi dengan suspensi bakteri spons yang akan diuji kemudian diinkubasi selama 24 jam, setelah diinkubasi dilihat apakah terdapat zona bening disekitar koloni bakteri yang diuji yang tumbuh disekitar kertas cakram.  Jika terdapat zona bening maka bakteri tersebut menghasilkan senyawa bioaktif sebagai antibakteri (Nofiani et al. 2009).

Metode Skrining Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp. Sebagai

      Penghasil Senyawa Antimikroba(Abubakar et al, 2011)

a. Tahap Persiapan

Spons Jaspis sp. diambil menggunakan pisau steril dengan ukuran panjang sampel  5–10 cm Sampel kemudian dimasukkan ke dalam plastik sampel (Whirl-Pak, Nasco, USA) yang telah diisi oksigen murni, selanjutnya ditempatkan dalam cool box untuk analisis  di Laboratorium. Setelah itu dilakukan Isolasi bakteri dari sampel spons tersebut. Permukaan sampel spons disemprot air laut steril dengan perbandingan ukuran spons 1 cm2 : 5 ml air laut steril, sehingga hanya bakteri dengan daya gabung yang kuat saja yang akan tersampling. Bagian mesohil diambil dengan ukuran + 1x1 cm, digerus dan diencerkan dengan Phospat Buffer Saline (PBS) steril dengan perbandingan 1:1 (Kim et al., 2006). Isolasi bakteri dari permukaan luar menggunakan swab steril (Wahl et al., 1994), yang diusapkan dengan satu arah pada permukaan luar spons. Swab steril yang telah diusapkan pada permukaan sampel dimasukkan ke dalam tabung pengenceran yang berisi PBS steril dan divorteks . Hasil pengenceran disebar ke dalam cawan petri yang telah berisi media Sea Water Complit (SWC) dengan komposisi 1 liter media terdiri dari 5 gr/l bacto pepton, 1 gr/l yeast extract dan 3 ml/l glycerol, dan diinkubasi pada suhu 26oC selama 24-36 jam dan diamati pertumbuhan koloni bakterinya. Setiap koloni bakteri yang tumbuh dipisahkan berdasarkan warna, ukuran dan bentuk koloni, serta dimurnikan dengan menggunakan media yang sama.

b. Tahap Screening

Screening dilaksanakan dengan pengujian aktivitas antagonis terhadap bakteri dan khamir patogen dilakukan secara kualitatif modifikasi Marinho et al., (2009), dengan menggores Isolat pada permukaan media yang telah disebar dengan bakteri uji. Bakteri uji yang digunakan terdiri dari bakteri gram negatif yaitu Escherichia coli, Pseudomonas aerogenosa patogen manusia  serta bakteri Gram positif yaitu Staphylococcus aureus patogen  dan S. aureus . Penguiian aktivitas antikhamir menggunakan khamir uji Candida albicans yang ditumbuhkan pada media Potato Dextrose Agar (PDA). Aktivitas antagonis terhadap bakteri dan khamir diindikasikan dengan terbentuknya zona jernih disekitar koloni isolat murni.

KESIMPULAN

Screening adalah sejenis tes yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi spesifik atau mikroorganisme dalam sejumlah besar spesimen. Tes skrining relatif mudah dan tidak mahal (peralatan yang dibutuhkan tidak terlalu rumit). Beberapa tes skrining masih dapat dilanjutkan dengan tes lain yang lebih spesifik.

Metode Skrining diantaranya :

-        teknik “paper disc diffusion technique”,

-        uji antibakteri dan antijamur dengan metode kertas cakram

-        pengujian aktivitas antagonis terhadap bakteri dan khamir patogen dilakukan secara kualitatif modifikasi

Metode Skrining pada mikroba sebelum dilakukan diperlukan tahap persiapan terlebih dahulu . Tahap persiapan biasanya sangat tergantung dengan jenis mikroorganisme dan karakteristiknya, misalnya dalam uji pewarnaan gram untuk bakteri, keasaman, temperatur, dan karakter mikroorganisme lainnya.

DAFTAR PUSTAKA

Abu bakar et al, 2011. Skrining Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp. Sebagai
             Penghasil Senyawa Antimikroba. ILMU KELAUTAN. Vol. 16 (1) 35-40

Defin et al, 2012. Penapisan Bakteri yang Bersimbiosis dengan Spons Jenis Aplysina sp
             sebagai Penghasil Antibakteri dari Perairan Pulau Tegal Lampung. Sumatera selatan.
             Universitas sriwijaya, Palembang

Kim, T.K., Hewavitharana, A.K., Shaw, P.N., & Fuerst, J.A. 2006.Discovery of a new source
             of rifamycin antibiotics in marine sponge actinobacteria by phylogenetic prediction.
             Appl. Environ. Microbiol., 72: 2118–2125

Lay. B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta. 167
             hlm.

Margino, S., 1997. "Tropical bioresources consevation for production useful materials".
             Training report. November 2-14 1997. Lab. Of Bioscience and Biochemistry, Faculty
             of Agriculture, Hokkaido University, Sapporo, Japan

Bacon, F. W., 1988. Procedur of Isolating the Endophytes from Tall Fescue and Screening
             Isolates for Ergot Alkaloids. Appl. Environ. Microbiol., 54:2615-2618

Margino, Sebastian. 2008. Produksi metabolit sekunder (antibiotik) oleh isolat jamur endofit
             Indonesia. Majalah Farmasi Indonesia, 19(2), 86 – 94, 2008

Marinho, P.R., Paula, A., Moreira, B., Lúcia, F., Costa,P., & Muricy, G. 2009. Marine
            Pseudomonas putida: a potential source of antimicrobialsubstances against antibiotic
            -resistant bacteria.Mem. Inst. Oswaldo Cruz., 104: 678-682

Nofiani. R, Nurbetty. S, Sapar. A. 2009. Aktifitas Antimikroba Ekstrak Metanol Bakteri
             Berasosiasi Spons Dari Pulau Lemukutan Kalimantan Barat. Universitas Tanjung
             Pura: Pontianak.

Pisano. M. A., Michael. J.S., & Madelyn. M.L., 1986. Application of pretreatments for the
             isolation of bioactive actinomycetes from marine sediments. Appl Microbiol.
             Biotechnol 25:285-288

Wahl, M., Jensen, P.R., Fenical, W.1994. Chemical control of bacterial epibiosis on
             Ascidians. Mar. Ecol. Prog. Ser., 110: 45–57.